Лейкоз КРС: разбор методов диагностики

Автор: Диана Михеева, ветеринарный консультант лаборатории ЯРВЕТ

Лейкоз крупного рогатого скота остается одной из наиболее значимых проблем современного животноводства как в России, так и во многих странах мира. Заболевание вызывается вирусом лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС), относится к хроническим инфекциям ретровирусной природы и сопровождается значительным экономическим ущербом вследствие снижения продуктивности, выбраковки животных и ограничений на племенную работу. Несмотря на длительное применение противоэпизоотических мероприятий, в ряде регионов эпизоотическая ситуация остается напряженной [1].

В современной ветеринарной практике используются три основных направления лабораторной диагностики:

• серологические методы (реакция иммунодиффузии — РИД и иммуноферментный анализ — ИФА),
• молекулярно-генетические методы (полимеразная цепная реакция — ПЦР),
• гематологические исследования.

Каждый из методов обладает собственными диагностическими возможностями и ограничениями, что в ряде случаев обусловливает расхождение результатов при обследовании одного и того же поголовья.

1. Серологические методы диагностики (РИД и ИФА)

Основой массовой диагностики лейкоза КРС в России являются серологические методы, прежде всего ИФА и РИД. Они давно стандартизированы, а стоимость исследований относительно невысока.

Оба метода ищут антитела к вирусу, но РИД — качественный метод (реакция в геле, визуальная оценка («есть полоска/нет полоски»), а ИФА — количественный метод, позволяющий не только найти, но и оценить уровень антител.

Что важно знать:

• ИФА предпочтительнее РИД. Метод ИФА продемонстрировал более высокую специфичность и чувствительность, позволяя выявлять инфицированных животных на более ранних стадиях заболевания по сравнению с РИД. Это делает его предпочтительным инструментом для скрининговых исследований. [2]
• Главный минус серологии — «серонегативное окно». Это период между инфицированием и появлением диагностически значимого уровня антител. В этот период возможно получение ложноотрицательных результатов, что особенно критично при раннем выявлении инфекции.[4]

2. Молекулярно-генетическая диагностика (ПЦР)

Преодолеть ограничения серологических методов позволяет полимеразная цепная реакция, направленная на выявление интегрированной провирусной ДНК ВЛКРС у инфицированного животного. В отличие от серологических тестов ПЦР напрямую обнаруживает генетический материал вируса.

ПЦР является более чувствительным методом по сравнению с серологическими тестами и обеспечивает выявление инфекции на ранних стадиях независимо от состояния гуморального иммунного ответа.

• В исследовании Fechner (1996) методом ПЦР выявили на 10% больше зараженных животных, чем ИФА, и на 17,7% больше, чем РИД [5].
• Это особенно важно в стадах с низким распространением инфекции (<5%), где серологические тесты пропускают часть зараженных животных (в исследовании из 52 ПЦР-положительных животных ИФА верно определил только 43, а РИД — 37).

Когда предпочтительна ПЦР-диагностика:

• для молодняка до 6 месяцев (только ПЦР позволяет отличить зараженного теленка от животного с циркулирующими материнскими антителами);
• при сомнительных или противоречивых результатах серологических исследований;
• для раннего выявления при недавнем заносе инфекции;
• для выявления «алейкемических» носителей (животных, у которых вирус присутствует, но иммунный ответ слабый).

Несмотря на то, что ПЦР является чувствительным методом, он имеет свои ограничения:

• Результаты ПЦР зависят от выбора мишени (гена), протокола выделения ДНК и порога чувствительности тест-системы. Поэтому анализ одной и той же пробы в разных лабораториях иногда даёт противоречивые результаты.
• Согласно данным Pluta et al. (2024), ПЦР методы в разных лабораториях хорошо коррелируют между собой, однако могут давать расхождения на образцах с низкой провирусной нагрузкой (менее 100 копий на 100 нг ДНК [7]. При низкой концентрации вируса в пробе возможны ложноотрицательные результаты.

Несмотря на технологические различия, современные ПЦР-методы обеспечивают надежное выявление инфицированных животных независимо от уровня иммунного ответа.

3. Гематологические методы

Гематологическое исследование занимает особое место в диагностике лейкоза КРС, поскольку позволяет оценить стадию патологического процесса, то есть признаки перехода инфекции в гематологическую стадию.

Ключевыми диагностическими критериями являются:

• абсолютный лимфоцитоз, оцениваемый с использованием «лейкозного ключа» с учетом возраста животного;
• морфологические изменения лимфоидных клеток (в том числе клетки Ридера).

Что важно знать:

• По данным Nakada и соавт. (2018), животные с высокими показателями лимфоцитов характеризуются высокой провирусной нагрузкой и являются основными источниками распространения инфекции в стаде [6].
• Именно на основании гематологических исследований можно принять решения об изоляции или выбраковке животных из стада.

Кого исследовать и когда? Как выбрать метод?

В идеале диагностика должна быть комплексной. Не следует заменять один метод другим — их применяют в зависимости от цели и ситуации.

Главное, проводить массовые скрининги регулярно:

• Исследование Ruggiero et al. (2019) показало, что стратегия, основанная на регулярном скрининге (в данном случае — ИФА) и выбраковке положительных животных, является эффективным методом снижения распространенности вируса лейкоза (BLV) в стадах с исходно низким уровнем инфицирования. Это подтверждает, что активный диагностический мониторинг является ключевым инструментом контроля заболевания [8].
• Успех программы контроля напрямую зависит от постоянного наблюдения. В одном из трех исследуемых стад распространенность BLV вновь выросла после завоза инфицированных животных, выращенных за пределами основного хозяйства. Это подтверждает, что скрининг не может быть разовым мероприятием. Для предотвращения повторного заноса инфекции необходим карантин и тестирование всех вновь поступающих животных.

Кого исследовать:

• молодняк до 6 месяцев (ПЦР);
• всех животных старше 6 месяцев (ИФА/РИД);
• вновь поступающих животные в период карантина (не менее 30 суток);
• поголовье при проведении плановых противоэпизоотических мероприятий.

При проведении серологических исследований необходимо учитывать следующие временные ограничения:

• не ранее чем через 30 суток после вакцинации или введения аллергенов;
• у стельных животных — за 30 суток до отела или через 30 суток после него;
• при сомнительных результатах гематологического исследования — повторное обследование через 1–2 месяца;
• в неблагополучных хозяйствах — регулярные исследования с интервалом 6 месяцев. [3]

Ниже предлагаем вам алгоритм диагностики лейкоза, объединяющий разные лабораторные методы.

Заключение

Ни один из существующих методов не является универсальным. Современная стратегия мониторинга лейкоза КРС должна строиться на комплексном применении трёх лабораторных методов:

• Серологические методы (РИД и, в особенности, более чувствительный ИФА) остаются «золотым стандартом» массового скрининга благодаря экономической доступности и стандартизированности. Однако основным ограничением серологического подхода остается его неинформативность в период серонегативного окна, а также низкая диагностическая ценность при тестировании молодняка, имеющего материнские антитела.
• Молекулярно-генетические методы (ПЦР) позволяют преодолеть указанные ограничения, обеспечивая прямое выявление провирусной ДНК на ранних этапах инфицирования. ПЦР превосходит серологию по чувствительности, что делает её незаменимой для подтверждающей диагностики, работы в стадах с низкой распространенностью вируса и контроля ввозимых животных.
• В свою очередь, гематологические методы сохраняют свою значимость для клинической оценки стадии заболевания, позволяя идентифицировать животных с высокой провирусной нагрузкой — основных источников распространения вируса в стаде с последующей выбраковкой.

Таким образом, современная стратегия лабораторного мониторинга лейкоза КРС должна строиться на комплексном применении методов: массовый скрининг (ИФА), верификация и раннее выявление (ПЦР), оценка стадийности процесса (гематология). Только такой многоуровневый подход, реализуемый на фоне строгого соблюдения ветеринарно-санитарных правил (карантин, изоляция), способен обеспечить надежный контроль эпизоотической ситуации и предотвратить повторный занос вируса в благополучные стада.

При подготовке использованы материалы:

1. Апалькин В.А., Гулюкин М.И., Петров Н.И. Лейкоз крупного рогатого скота. - СПб.: Петролазер, 2005. - 105 с. https://cyberleninka.ru/article/n/leykoz-krupnogo-rogatogo-skota

2. Байсеитов С. Т., Новикова Н. Н., Власенко В. С., Красиков А. П. Сравнительная оценка диагностической эффективности РИД, ИФА и РНИФ при лейкозе крупного рогатого скота // Вестник ОмГАУ. 2020. №1 (37). https://cyberleninka.ru/article/n/sravnitelnaya-otsenka-diagnosticheskoy-effektivnosti-rid-ifa-i-rnif-pri-leykoze-krupnogo-rogatogo-skota

3. Министерство сельского хозяйства российской федерации, приказ от 24 марта 2021, №156 «Об утверждении Ветеринарных правил осуществления профилактических, диагностических, ограничительных и иных мероприятий, установления и отмены карантина и иных ограничений, направленных на предотвращение распространения и ликвидацию очагов лейкоза крупного рогатого скота» https://docs.cntd.ru/document/603433105?marker=6540IN

4. Мищенко, В. А. Влияние физиологического и иммуно-биологического статуса крупного рогатого скота на уровень поствакционного иммунитета / В. А. Мищенко, А. В. Кононов, А. В. Мищенко [и др.] // Ветеринария Кубани. – 2008. – № 2. – URL: http://www.vetkuban.com/num2_20083.html

5. Fechner H, Kurg A, Geue L, Blankenstein P, Mewes G, Ebner D, Beier D. Evaluation of polymerase chain reaction (PCR) application in diagnosis of bovine leukaemia virus (BLV) infection in naturally infected cattle. Zentralbl Vet Reihe B J Veterinary Med Ser B. 1996;43(10):621–630. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/9011158/

6. Nakada S, Kohara J, Makita K. Estimation of circulating bovine leukemia virus levels using conventional blood cell counts. J Dairy Sci. 2018;101:11229–36. 10.3168/jds.2018-14609 https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30292546/

7. Pluta A., Rola-Łuszczak M., Doukkali M.A. et al. International comparative study of low and high throughput qPCR and ddPCR for the diagnosis of bovine leukemia virus infection (BLV) in cattle. BMC Veterinary Research. 2024. Vol. 20. Article 345. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39187880/

8. Ruggiero VJ, Bartlett PC. Control of Bovine Leukemia Virus in Three US Dairy Herds by Culling ELISA-Positive Cows. Vet Med Int. 2019;2019:3202184. 10.1155/2019/3202184 https://www.hindawi.com/journals/vmi/2019/3202184/